隨著輔助生殖技術的不斷發展，越來越多的不孕不育夫婦通過行體外受精－胚胎移植（IVF-ET）成功孕育下一代。作為丈夫取出優質的精子很重要，然而，在接受輔助生殖技術助孕的患者中，一些患者由于精神壓力、心理因素、取精環境等各種原因導致取精失敗。取精失敗將直接導致取卵移植手術取消。本研究對IVF-ET過程中可能出現取精困難的患者在取卵前提前進行精液冷凍，并與取卵當天成功取出新鮮精液的患者的胚胎情況進行比較，以評價提前冷凍精液在取精困難患者中的可行性及對妊娠結局的影響。

資料與方法

１．１一般資料：

回顧性分析2018年１月至2019年１２月進入體外受精（IVF）周期取精困難男性患者７０例及其配偶。男方納入標準：１）既往有取精困難史或取精失敗者；２）取卵日前曾順利取過精液，且有精子；３）無不射精病史或逆行射精；４）卵泡刺激素（FSH）、黃體生成素（LH）、催乳激素（PRL）、雌激素（E）、雄激素（T）正常。

夫婦雙方均自愿簽署知情同意書并且男方均提前冷凍精液。女方納入標準：月經規律正常，子宮卵巢形態正常，促排方案均采用促性腺激素釋放激素激動劑（GnRH-a）超長方案。其中男、女方年齡分別為（34.73±5.48）歲和（31.91±3.44）歲，不孕年限（3.31±1.83）年，女方BMI（21.57±1.83）ｋｇ／ｍ２。

70例中取卵日重新獲取新鮮精液40例（新鮮組），取卵日取精失敗使用冷凍精液30例（冷凍組）。兩組間的年齡、不孕年限、女方ＢＭＩ、移植胚胎數、平均獲卵數等基本資料對比，差異無統計學意義（Ｐ＞0.05，表１）。

１．２方法：

１．２．１ＧｎＲＨ－ａ超長方案：女方于月經周期第２～５天肌內注射或皮下注射長效藥物進行降調節。Ｂ超監測卵泡發育，卵泡≥18ｍｍ時，肌注人絨毛膜促性腺激素（HCG）10000Ｕ。注射后３６ｈ行Ｂ超引導經陰道取卵術。

１．２．２精液冷凍、解凍及優化處理：按照《ＷＨＯ人類精液檢查與處理實驗室手冊》第５版，利用超低溫冷凍技術冷凍精液。冷凍方法為液氮熏蒸法：室溫下操作，用一次性無菌吸管按照等體積加入精子冷凍液，逐滴加入；邊加邊輕柔搖晃取精杯，使之充分混勻；加完后，準備好精子冷凍管，一般為1.8ｍＬ／管，加入精液和精子冷凍液的混合液體，于液氮面上熏蒸，最后投入液氮罐。解凍方法：37℃水浴箱20ｍｉｎ；涂片顯微鏡檢查；根據解凍后的精液濃度及前向活動率行IVF，解凍后濃度活力不足IVF的，需行卵胞漿內單精子注射技術（ICSI）助孕治療。IVF精液優化處理為梯度離心加上游法。

１．３觀察指標：

１）囊胚評分：16-20ｈ后觀察精卵結合情況，正常受精后進行卵裂期胚胎和囊胚期的囊胚評分，具體的胚胎評分標準參照《人類體外受精胚胎移植實驗室操作專家共識（2016）》。正常受精率＝雙原核（２PN）受精數／獲卵數×100％。卵裂率＝受精卵裂數／雙原核受精數×100％。優質胚胎率＝優質胚胎數／雙原核受精卵裂數×100％。囊胚形成率＝形成囊胚數／囊胚培養數×100％。

２）臨床妊娠：移植14ｄ后，查血HCG確認妊娠；第３５天Ｂ超，可見到孕囊及心管搏動確定為臨床妊娠。妊娠率＝妊娠周期數／移植周期數×100％。

１．４統計方法：

采用SPSS22.0統計軟件分析數據。年齡、不孕年限、女方ＢＭＩ、移植胚胎數、平均獲卵數采用ｘ±ｓ表示，兩組間比較采用兩樣本ｔ檢驗；正常受精率、卵裂率、優質胚胎率、囊胚形成率和臨床妊娠率采用χ２檢驗。Ｐ＜0.05為差異有統計學意義。

結果

兩組間的正常受精率、卵裂率、囊胚形成率、優質胚胎率和臨床妊娠率差異均無統計學意義（Ｐ＞0.05），見表２。

討論

在接受輔助生殖技術過程中，取精困難是不可避免的意外情況。針對取精困難，干預措施較多，比如睪丸或附睪穿刺取精、卵子玻璃化冷凍技術。通過睪丸或附睪取出的精子量少，不足以IVF，必須改行ICSI，這樣不僅會改變患者的授精方式，而且與常規IVF相比，ICSI是否能夠提高胚胎質量，是否能夠獲得更好的臨床結局尚無定論。

有研究認為ICSI既不能改善胚胎質量，也不能改善臨床結局，并且ICSI可能存在安全隱患，會對胚胎造成負面影響。同時，進行ICSI技術所需要的精力和費用也更多。盡管國內有研究表明，卵子玻璃化冷凍技術在輔助生殖中具有較好效果，有助于保存女性生育能力；但是由于卵子細胞大、體表面積與體積比小、含水分多、卵子的紡錘體及其他細胞器對溫度敏感等因素，使得這項技術難以普及。

目前精子冷凍技術比較成熟，患者容易接受，因此本中心把提前冷凍精液作為優先采取的措施。患者提前冷凍精液時，取精環境更加安靜，取精時間更加充裕，因此患者成功取出精液的概率更高。不少患者就因為有了“凍精”作為保底的心理暗示，于女方取卵日順利取出精液。但是，對于冷凍精子是否會對胚胎質量及妊娠結局造成影響，一直是臨床最為關心的問題。本文結果顯示，兩組間的正常受精率、卵裂率、囊胚形成率、優質胚胎率和臨床妊娠率差異均無統計學意義，這說明精液冷凍可能不會影響胚胎的質量，并且不會影響妊娠結局。

這與文獻報道的結果一致。這主要是因為，在精液冷凍過程中，精子通過精液冷凍液的脫水作用能夠將細胞內的水分幾乎完全置換到細胞外，細胞在－196℃的液氮中冷凍時，剩余的水分不易造成大冰晶，所以不會損傷精子的微絲微管；精子在復蘇后，完整的精子可以順利完成精卵結合。有研究報道，冷凍精子復蘇后會增加精子的ＤＮＡ損傷，影響精子的ＤＮＡ碎片率。精子ＤＮＡ碎片率升高，正常受精率、優質胚胎率、囊胚形成率和妊娠率會降低。

但是，卵子和胚胎對ＤＮＡ具有一定的修復能力，其中胚胎對精子ＤＮＡ損傷修復能力的大小與母系基因的完整性和卵子的質量密切相關。有學者認為，對于精子ＤＮＡ碎片率較高以及嚴重少、弱、畸形精子癥的標本，采用密度梯度離心法能夠收集形態正常和活力較好的精子。本文中冷凍組和新鮮組的精液均采用密度梯度離心加上游法處理，處理后濃度及活力均達到標準。

綜上所述，預知取卵日可能會取精失敗的患者可提前冷凍精液，這種辦法是可行的，并且不會影響胚胎質量和妊娠結局。當然，體外受精－胚胎移植治療中，應做好足夠的應對措施，盡量避免因取卵日男方無法提供足夠精子而選擇卵子冷凍。